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甘草查尔酮A抑制THP-1巨噬细胞促炎因子表达的影响：依赖于TLR-4/NF-κB炎症信号通路
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龙小琴1 ，戴应和1，袁经权1,2#，易蔚1#
（1.广西中医药大学 药学院，南宁 530001；2.广西药用植物研究所，南宁 530023；）
[关键词] 甘草查尔酮A；THP-1细胞；Toll样受体-4（TLR- 4）；核因子κB
[摘要] 目的 探讨甘草查尔酮A（Licochalcone A，Lico A）对脂多糖（LPS）诱导的人急性单核细胞白血病细胞株（THP-1）巨噬细胞相关炎症因子表达的影响。方法 用100 ng /mL的佛波酯(PMA) 诱导THP-1细胞48 h，使其分化为巨噬细胞后，分为对照组、LPS组和LPS +不同浓度（20、10、5 μmol/L）的Lico A处理组。用酶联免疫吸附法检测细胞培养液中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的含量，实时定量PCR检测Toll样受体-4（TLR-4）和核因子κB（NF-κB） mNRA水平，采用Western blot 检测TLR-4、NF-κB、IκB激酶（IKKα）、磷酸化IKB-α（p-IKB-α）、环氧合酶-2（COX-2）、和一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达水平。结果 LPS诱导THP-1巨噬细胞后IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，Lico A可降低LPS诱导引起的IL-1β、IL-6和TNF-α 表达水平升高。LPS 刺激后TLR-4 mNRA 及蛋白表达增加，NF-κB 活化，Lico A可拮抗以上作用，阻止NF-κB 活化。结论Lico A可通过TLR-4/NF-κB 通路抑制LPS诱导的THP-1巨噬细胞炎性反应。
[中图分类号] R363 [文献标识码] A
动脉粥样硬化( atherosclerosis，AS) 是一种多因素参与，且发病机制极为复杂的血管炎症性疾病［1］。研究表明，血管壁胆固醇蓄积和炎症反应是AS发生发展的两个关键环节，也是造成冠状动脉疾病发病和死亡的主要原因 [2]。近年来，研究发现巨噬细胞释放的白细胞介素-1β（interleukin-1 beta,IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor alpha,TNF-α）等炎症因子相互协同共同参与、相互诱导，促AS 的发生发展，形成恶性循环［3］。因此，炎症因子与As的发生和恶化有着密切的关系，所以抑制炎症因子是改善AS疾病恶化的重要途径。
甘草作为中国的传统中药，具有清热解毒，缓急止痛，补脾益气，祛痰止咳，调和诸的功效。大量研究表明[6]，甘草具有抑制平滑肌细胞的增殖、保护血管内膜、稳定斑块、调节脂质，抗炎、抗氧化，调节免疫等方面，常用于治疗AS在内的各种炎症疾病[4，5]。甘草查尔酮A（Licochalcone A，Lico A）是一种酚类查尔酮化合物，是甘草主要活性成分之一。目前国内外研究表明，Lico A具有抗炎[ 7 ]、抗氧化[8]、抗肿瘤[ 9 ]、免疫促进[10]等多种生物活性，对AS的防治有益。然而，关于Lico A是否能抑制Toll样受体 4(Toll like receptor 4,TLR 4)，从而抑制核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）信号通路减少炎症因子分泌呢？目前尚未明确。为了探讨甘草查尔酮A抑制THP-1巨噬细胞促炎因子表达的影响：依赖于TLR-4/NF-κB炎症信号通路。本研究用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS) 刺激人急性单核细胞白血病（THP-1）细胞源性巨噬细胞分泌促炎因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α），再观察Lico A对促炎因子释放的影响，并探讨其机制。
1 材料与方法
1.1细胞株
THP-1（人急性单核细胞白血病细胞株）细胞株，购自中国医学科学院基础研究所细胞中心。
1.2主要试剂和仪器
高糖RPMI-1640培养基、青霉素链霉素混合液（美国Invitrogen公司）；胎牛血清，北京圣马元亨生物科技公司；佛波酯( phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)，脂多糖（LPS），四甲基偶氮唑蓝（MTT），二甲基亚砜（Sigma 公司）； PCR试剂盒，RNA 提取试剂盒，cDNA 反转录试剂盒（Invitrogen 公司），引物（上海生工生物工程有限公司）Tween 20（美国Fluka公司）；白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA检测试剂盒（武汉华美生物科技有限公司）；高灵敏度化学发光检测试剂盒，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，5 × loading buffer，BCA蛋白定量试剂盒，哺乳动物组织蛋白抽提试剂（北京康为世纪生物科技有限公司）； PVDF膜（美国Millipore公司）； IKKα、p-IκB-α、NF-Κb、TLR 4等抗体（美国Santa Cruz公司）；辣根过氧化物酶偶联山羊抗兔抗体，辣根过氧化物酶偶联山羊抗小鼠抗体（北京康为世纪生物科技有限公司）。5410型二氧化碳培养箱(NAPCO，美国)；MQX200 型酶标仪(Bio-Tek，美国)；BCN-1360 型生物洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；CKX41 倒置荧光显微镜(Olympus，日本)；Labofuge 400R 离心机(Heraeush，德国)；EDC-810 PCR 扩增仪（东胜）。
1.3 THP-1细胞培养
将THP-1 细胞接种在含有10% FBS的RPMI-1640完全培养基中，置于37℃培养箱内培养。根据已有文献报道[11]，将THP-1细胞重悬以1×l05 cells/ml接种于6孔板内，每孔加入1 mL, 置于37℃孵育箱分别培养12 h后，加入终浓度为100 ng /mL PMA（用含有10% FBS的RPMI-1640完全培养基稀释），作用48 h诱导分化为巨噬细胞。
1.4受试药物
本实验所用Lico A由天津中兴新药有限公司提供，货号58749-22-7，高效液相色谱含量分析和化学结构见图3.1，纯度>98%。
图1. Lico A化学结构及高效液相色谱含量分析
Figure 1 Chemical structure of Lico A, purity above determined by HPLC
1.5不同浓度的Lico A对THP-1分化的巨噬细胞增殖的影响
取Lico A原粉10 mg加DMSO 4 ml充分溶解（且DMSO的最终浓度不超过19 %），配制成2500 μg/ml母液，密封后-20℃冰箱保存备用。离心收集对数生长期的THP-1细胞，1×105个/孔接种于96孔板（100 μl/孔），重复5孔，加入100 nmol /L PMA 孵育THP-1 细胞48 h，使其分化为巨噬细胞；去除培养上清，加入RPMI-1640 培养基洗涤2次，洗去未贴壁的THP-1 细胞，然后加入用RPMI1640完全培养液溶解Lico A（浓度：5、10、20、40、80 μg/mL），每个浓度设5个复孔。在培养24h后，每孔加入10μL 5 mg/mLMTT，继续孵育4 h，弃上清液，每孔加入200 μL DMSO，轻振荡混匀，10 min后，酶标仪测定每孔在540 nm处的吸光度（OD值），观察Lico A对THP-1分化的巨噬细胞增殖的影响。
1.6 不同浓度、不同时效Lico A对LPS诱导的THP-1 巨噬细胞炎症因子分泌的影响
根据MTT检测结果将细胞分为5组：空白组、模型组（LPS 1μg/mL）、Lico A低剂量组（低浓度Lico A 5μg/mL＋LPS 1μg/mL）、Lico A中剂量组（中浓度Lico A 10μg/mL＋LPS 1μg/mL）、Lico A高剂量组（高浓度Lico A 20μg/mL＋LPS 1μg/mL）。离心收集对数生长期的THP-1细胞，1×105个/孔接种于96孔板（100μl/孔），重复5孔，加入160 nmol /L PMA 孵育THP-1 细胞48h，使其分化为巨噬细胞；去除培养上清，加入RPMI-1640 培养基洗涤2次，洗去未贴壁的THP-1 细胞，然后加入用在上述各组药物，空白对照加等量的RPMI1640完全培养液。在培养12、24、48h后，收集细胞上清液，－80℃冰箱储存备用。每次检测前从冰箱前取出样本，置于室温环境中充分冻融混匀，严格参照ELISA 试剂盒操作说明测定IL-1β、IL-6和TNF-α含量。
1.7实时定量PCR检测Lico A对LPS诱导的THP-1 巨噬细胞TLR-4、NF-κB mRNA 表达水平的影响
将THP-1 巨噬细胞接种于培养瓶中，经同“1.4”项方法分组处理后，对细胞总RNA的提取并反转录合成cDNA，扩增。严格按照试剂盒的步骤进行实验操作。TLR-4的引物序列（5'-3'）为：上游：TAACGGATTCCGGAATCCCTGA，下游：CGATTAAGGTAAAGTCCAG A；NF-κB的引物序列（5'-3'）为：上游：TCAAGCCTAAGGCCTTAAGG，下游：GAACCTGGC AATCCTGAAGA［12］。依照操作步骤在每孔依次加入1 μL cDNA、25 μL 2 × mix、3' 和5' 端引物( 10 μmol /L) 各1 μL，无菌水19 μL。通过PCR 仪进行反应，每组5 个平行样品。反应条件: 95℃预变性5 min，( 97℃ 30 s、65℃ 20 s、72℃ 30 s) ×35 个循环; 最后，72℃延伸7 min。采用实时定量PCR 实验中样本基因的Ct值。通过β-actin 的Ct值均一化，即ΔCt = Ct样本－Ct内参，而样本基因mRNA 相对丰度值以ΔΔCt值表示，ΔΔCT = 2－ΔCt。
1.8 Lico A对LPS诱导的THP-1 巨噬细胞中TLR-4、NF-κB、IκB激酶（IKKα）、磷酸化IKB-α（p-IKB-α）、环氧合酶-2（COX-2）、和一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达水平
参照文献［13］，根据实验1.5，将5组细胞诱导分化、加药处理，培养24h，收集处理好的细胞，加细胞裂解液，4℃ 低温12000 r /min 离心10 min。对裂解的细胞总蛋白上清液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，将各组的蛋白浓度调到同一水平。制备10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶，每孔加蛋白样品，经电泳后通过半干式电转仪将分离的蛋白转到硝酸纤维素滤膜上。将膜用5%脱脂牛奶含有0.1%吐温20的（TBST）在摇床上封闭2 h，加入一抗后4℃下孵育过夜，用TBST 洗膜3次，每次15 min；加入二抗之后，放在摇床孵育2 h，用TBST 洗3次，每次15 min，后加入发光显色剂ECL显色，应用凝胶成像系统扫描分析白条带灰度，计算各蛋白条带与内参照β-actin的比值。
1.9统计学分析
应用SPSS13.0软件进行统计分析，各组数据均以均数±标准差( )表示，组间比较用单因素方差分析，计量资料组间比较用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2实验结果
2.1 PMA诱导单核细胞分化巨噬细胞的结果
图2结果显示，单核细胞THP-1 未诱导前是悬浮细胞，经PMA 诱导24 h后，细胞有伪足伸出，并贴壁生长的，形状圆形变成椭圆形或梭型，与文献[11]一致。
未诱导组 PMA 诱导组
图2 PMA诱导单核细胞分化巨噬细胞的形态观察（×40）
Figure 2 Morphological Observation of macrophages induced by PMA in monocytes (×40)
2.2 Lico A对THP-1分化的巨噬细胞增殖的影响
由图3结果可知， Lico A在5～20μg/mL内对HepG2细胞的增殖均无抑制作用，随着浓度的增大在大于或等于 40μg/mL有一定抑制作用P<0.01或P<0.05。故Lico A的浓度均为5～20μg/mL内用于后续试验研究。
图3 不同浓度的Lico A对THP-1分化的巨噬细胞增殖的影响 a为P < 0.05，b为P<0.01，与空白组比较。
Figure 3 Effect of different concentrations of Lico A on the proliferation of THP-1 differentiated macrophages
2.3 不同浓度的Lico A作用不同时间对LPS诱导的THP-1 巨噬细胞炎症因子分泌的影响
由图4实验结果可知，与对照组比较，LPS模型 组IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显升高(P＜0.01) ，其含量随着时间的增加而增加; 与LPS模型组比较，LPS+不同浓度Lico A组IL-1β、IL-6和TNF-α水平均有所下降(P＜0.05或P<0.01)，且Lico A浓度越大，下降越明显，且Lico A处理时间越长，下降越明显。提示Lico A不仅可呈浓度依赖性抑制THP-1 巨噬细胞炎症因子的分泌，也呈时间依赖性抑制THP-1 巨噬细胞炎症因子的分泌。
图4 Lico A对脂多糖诱导THP-1 巨噬细胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量(n=5) ##为P < 0.01，与空白组比较； *为P < 0.05，**为P<0.01，与模型组比较。
Figure 4 content of IL-1, IL-6 and TNF-α in supernatant of LPS induced THP-1 macrophages by Lico A(n=5)
1.5实时定量PCR检测Lico A对LPS诱导的THP-1 巨噬细胞TLR-4、NF-κB mRNA 表达水平的升高
通过PCR实时定量检测Lico A对脂多糖诱导的THP-1 巨噬细胞TLR-4、NF-κB mRNA 表达水平从图5可知，与对照组比较， LPS模型 组TLR-4、NF-κB mRNA 表达水平明显升高(P＜0.01); 与LPS模型组比较，LPS+不同浓度Lico A组TLR-4、NF-κB mRNA 表达水平均有所下降(P＜0.05或P<0.01)。提示Lico A可以抑制LPS诱导的THP-1 巨噬细胞TLR-4、NF-κB mRNA 表达水平。
图5 实时定量PCR检测Lico A对LPS诱导的THP-1 巨噬细胞TLR-4、NF-κB mRNA 表达水平的影响(n=5) ##为P < 0.01，与空白组比较； *为P < 0.05，**为P<0.01，与模型组比较。
Figure 5 Quantitative real-time PCR was used to detect the effects of Lico A on the expression of TLR-4 and NF-kappa B mRNA in THP-1 macrophages induced by LPS
2.4 Lico A对LPS诱导的THP-1 巨噬细胞中TLR-4蛋白表达水平
由图6实验结果表明：与对照组比较，LPS 组TLR-4蛋白表达明显增加，差异有显著统计学意义( P < 0. 01)；与LPS模型组比较，LPS+不同浓度Lico A组能够降低TLR-4蛋白表达明 (P＜0.05或P<0.01)，提示Lico A可抑制LPS诱导的THP-1 巨噬细胞中TLR-4蛋白表达水平。
图6 Lico A对LPS诱导的THP-1巨噬细胞中TLR-4蛋白表达水平的影响(n = 3) ##为P < 0.01，与空白组比较； *为P < 0.05，**为P<0.01，与模型组比较。
Figure 6 Effect of Lico A on TLR-4 protein expression in LPS induced macrophages (n = 3)
2.5 Lico A对LPS诱导的THP-1 巨噬细胞中NF-κB、IKKα、P-IkBα、COX-2和iNOS蛋白表达水平
由图7实验结果表明：与对照组比较，LPS 组NF-κB、IKKα、P-IkBα、COX-2和iNOS蛋白表达明显增加(P＜0.05)；与LPS模型组比较，LPS+不同浓度Lico A组能够降低NF-κB、IKKα、P-IkBα、COX-2和iNOS蛋白表达明 (P＜0.05或P<0.01)，高剂量十分明显(P<0.01)，提示Lico A可抑制LPS 诱导的THP-1 巨噬细胞炎性蛋白的表达。
图7 Lico A对LPS诱导的THP-1巨噬细胞中NF-κB、IKKα、P-IkB-α、COX-2和iNOS蛋白表达水平的影响(n = 3) ##为P < 0.01，与空白组比较； *为P < 0.05，**为P<0.01，与模型组比较。.
Figure 7 effect of Lico A on the expression of NF- kappa B, IKK alpha, P-IkB alpha, COX-2 and iNOS in LPS induced macrophages
4讨论
AS形成的最常见因素就是炎症细胞，Ross教授[14]提出“AS是一种炎症性疾病”。单核-巨噬细胞是机体主要的免疫细胞，是构成AS斑块重要部分，同时也是易损斑块形成的重要病理生理学基础[15]。As斑块中的单核-巨噬细胞能够分泌的IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子，能促进单核细胞聚集、巨噬细胞的增殖以及平滑肌细胞的迁移、增殖，使As斑块不断进展[16]。IL-1β能协同刺激抗原递呈细胞，间接影响嗜中性白细胞到达炎症部位释放氧自由基[17,18]。IL-6既能促进细胞毒性T细胞成熟，又能促进B细胞分化并产生免疫球蛋白[19]。TNF-α能够诱导其他炎症因子，在调节炎症反应中起关键作用，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子以及粘附分子的产生 [20,21]。研究表明，动脉粥样硬化斑块中的单核细胞受刺激后可分泌的IL-1β、IL-6和TNF-α炎症因子，通过与靶细胞表面的受体特异结合后，从而可促进炎症反应的发生，在冠心病的血管损伤和急性心肌缺血中发挥着关键作用。
LPS是诱导炎症因子如白介素、单细胞趋化蛋白、氧自由基等大量表达，易导致促进炎症和抵抗炎症系统之间失衡，从而产生炎症的细菌内毒素。THP-1 细胞是人类急性单核细胞白血病细胞株，具有单核细胞特性，能够被 LPS 等诱导致炎，细胞增殖状态良好，且能培养传代，是研究单核细胞功能的常用载体[22]。Toll 样受体(TLRs)是介导先天免疫和炎性反应的主要受体，研究证实了TLR-4与人类动脉粥样硬化的关系最为密切[23-25]。NF-κB是经典的炎症通路，NF-κB未被激活时和IκB-α形成一个复合物IkB激酶(IKK)存在于细胞浆中。当细胞受到刺激时，IKK被激活，使IκB被磷酸化，IκB从NF-κB上脱落并被泛素化，NF-κB由抑制状态被激活，使IKB-α磷酸化形成p-IKB-α，从而直接参与机体对炎症及免疫反应的调控[26]。NF-κB在AS 形成中炎症反应中发挥枢纽作用，与AS 疾病的发生、发展有密切关系[27]。革兰阴性菌的胞壁成分LPS 主要是通过识别细胞膜上TLR-4受体，进而通过经典途径、旁路途径和非典型途径直接激活下游NF-κB，引起IL-1β、IL-6和TNF-α等多种炎症因子的增加，从而引起炎症反应的扩大和慢性炎症的持续[28,29]。以TLR-4为靶位，抑制或激活TLR 4表达或调控TLR-4/NF-κB炎症信号通路，是AS新的治疗策略[30]。
本实验中，以THP-1巨噬细胞为模型，用LPS 刺激其分泌炎症因子，再观察Lico A抑制THP-1巨噬细胞促炎因子表达的影响。结果发现，Lico A能够显著下降IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，且Lico A浓度的增加，下降越明显。在模型组中，LPS模型组的TLR-4、NF-κB mRNA 表达水平明显升高，表明LPS可能是通过TLR-4 受体使NF-κB 活化，并促进炎症因子的分泌；实验中发现，Lico A处理组中，TLR-4、NF-κB mRNA 表达水平均降低。为了进一步Lico A抑制THP-1巨噬细胞促炎因子表达的影响：依赖于TLR-4/NF-κB炎症信号通路。采用Western blot 检测TLR-4、NF-κB、IKKα、P-IkB-α、COX-2和iNOS蛋白表达水平，结果发现，与对照组比较，LPS模型组的TLR-4、NF-κB、IKKα、P-IkB-α、COX-2和iNOS蛋白表达明显增加；与LPS模型组比较，LPS+不同浓度Lico A组能够降低TLR-4、NF-κB、IKKα、P-IkB-α、COX-2和iNOS蛋白表达明，从而验证了Lico A抑制THP-1巨噬细胞促炎因子表达的影响：依赖于TLR-4/NF-κB炎症信号通路。关于使用上调TLR-4/NF-κB通路的激动剂后对于LPS诱导的巨噬细胞炎症因子分泌是否增加，体内效果如何？仍需进一步研究。
综上所述，本研究不仅验证了Lico A的能够抑制IL-1β、IL-6和TNF-α炎症因子的分泌，还从分子学角度出发，探讨了Lico A抑制LPS诱导的THP-1巨噬细胞中炎症因子表达的分子机制，即其可能是通过下调TLR-4表达，并抑制TLR-4/NF-κB炎症信号通路的活化，减少促进炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌。另外，间接揭示了Lico A抑制TLR-4/NF-κB炎症信号通减少促进炎性因子与As 的关系，为Lico A在治疗AS新药的开发提供一定依据。
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