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紫茎泽兰抗肝癌活性研究
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陈豪1,2，杨洁2，李余钊1,2，周蓓1，袁经权1,3*，杨新洲2, *
（1. 广西中医药大学，广西 南宁 530001；2. 中南民族大学药学院，湖北 武汉 430074；3. 广西药用植物园，广西 南宁 530023）
摘 要 目的：为充分利用紫茎泽兰，缓解其入侵问题，本实验对紫茎泽兰进行抗肝癌、抗氧化与抗炎活性评价，并对活性部位的毒性与抗肝癌机制进行研究。方法：运用MTT法、流式细胞术与免疫印迹法等分析紫茎泽兰各提取部位抗肝癌活性及活性部位抗肝癌机制；同时运用抗氧化试剂盒与酶动力学方法评价抗氧化与抗炎性能。结果：紫茎泽兰乙酸乙酯部位（EAEA）具有良好的抗肝癌活性，能引起凋亡相关蛋白caspase-3与PARP的活化，从而诱导肝癌细胞凋亡，但对正常肝细胞影响较小。此外，EAEA是紫茎泽兰主要的抗氧化部位，并对黄嘌呤氧化酶活性具有较好的抑制作用。结论：EAEA能通过激活线粒体凋亡通路发挥抗肝癌活性，同时还具有抗氧化、抗炎活性，具有极大的开发应用潜力。
关键词：肝癌；紫茎泽兰；凋亡；抗氧化；抗炎
中图分类号：R284.1/R285.5 文献标识码：A
肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常见的肿瘤之一，在全球恶性肿瘤中，HCC致死率居于第二位，同时也是我国常见的恶性肿瘤。全球每年约有78万例的HCC确诊，并且超过74万例的死亡与HCC相关[1; 2]。目前外科手术仍然是HCC患者首选的最佳治疗方式。但即使现在人类在诊断与治疗技术上已经取得了卓越的进步，大多数HCC患者确诊后生存期也仅为1年。因为除少数可以手术治疗的早期肝癌外, 现对进展期的HCC仍然没有合适的治疗方法，而大多数HCC案例确诊时已经不符合手术治疗的条件。因此，全身化疗是大多数HCC 患者最常接受的治疗方案。虽然如5 -氟尿嘧啶、顺铂和索拉非尼等药物已成功应用于临床治疗HCC，但毒副作用与耐药性等问题大大限制了它们的使用。为此，寻找与开发作用机制新颖，高效低毒的新型抗HCC药物依旧是药物研究的大势所向。天然产物一直是药物开发的一大重要来源，也是现今人们寻找有效抗肿瘤药物的研究热点之一。许多天然抗肿瘤药物如紫杉醇、喜树碱及其一系列衍生物已经广泛应用于临床。近年来学科间的交叉融合成为发展趋势，人们可以依凭更多的学科理论指导，从庞大的天然产物宝库中，高效筛选抗肿瘤活性物质。
泽兰属植物是我国重要的药用植物资源，分布在我国的泽兰属植物，近半具有药用价值。如佩兰、泽兰等更是传统应用的中药[3]。然而，在2003年中国第一批公布的外来入侵物种名单中, 泽兰属植物紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum Spreng.）居于榜首，已在广西、云南等地分布泛滥，严重危害了当地的生态经济环境。转化利用是有效控制这些入侵植物的一大新思路。研究表明，紫茎泽兰的化感物质是其与周围其他种类的动植物具有强大的生存竞争力的物质基础。这些化感物质已经在农业方面显示出巨大的潜力[4]。然而，紫茎泽兰目前在医药方面的研究非常薄弱。为了充分开发紫茎泽兰，变害为宝，本实验对紫茎泽兰进行了初步的抗肝癌活性研究。
本实验采用回流法制备紫茎泽兰石油醚（EAPE），乙酸乙酯（EAEA），正丁醇（EANB）与水（EAW）4个部位提取物，使用MTT法筛选抗肝癌活性部位；使用形态观察、流式细胞术与免疫印迹的方法，研究活性部位抗肿瘤机制。同时从总抗氧化能力、清除超氧阴离子能力、清除羟基自由基能力与抑制黄嘌呤氧化酶活性能力评价紫茎泽兰各部位的抗氧化、抗炎能力。综合以上研究，本实验为开发利用紫茎泽兰提供了基础，初步阐明了紫茎泽兰活性部位EAEA的药用价值与初步抗肝癌机制。
1 材料与方法
1.1 样品制备与试剂
紫茎泽兰药材于2016年7月采集于广西南宁，经广西中医药大学袁经权教授鉴定为菊科植物紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum Spreng.）的全草，药材标本（No. SC0184）存放于中南民族大学药学院标本馆。制备流程参照文献[5]的描述进行：取干燥的紫茎泽兰粉碎成粉末，称取10 g粉末，倒入250 mL 圆底烧瓶瓶中，加入80 mL 80%乙醇，电热套加热回流提取3 h，过滤出滤液，滤渣中加入80 mL 80%乙醇，继续加热回流提取3 h，过滤出滤液; 再次重复前两次操作，合并3 次提取所得滤液，减压浓缩得流浸膏，趁热加入水使溶液体积为100 mL。依次采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇三种溶剂萃取，每种溶剂萃取4次，每次50 mL，三种溶剂萃取溶液及残留的水溶液分别合并、浓缩及干燥，分别得到4个溶剂提取物部位，即石油醚（0.159 g）、乙酸乙酯（0.237 g）、正丁醇（0.339 g）和水提取物（0.672 g）。收集后的各提取物储存于-80 °C冰箱，临用前解冻后用DMSO进行溶解。MTT：Sigma公司；胎牛血清：上海拜力生物科技有限公司；DMEM培养基：上海拜力生物科技有限公司；双抗：上海博耀生物科技有限公司；一抗（anti-cleaved-caspase-3、anti-cleaved-caspase-9、anti-cleaved-PARP和anti-β-actin）与标记辣根过氧化物酶的鼠二抗、兔二抗：Cell Signaling Technology公司；抗超氧阴离子试剂盒、抗羟基自由基试剂盒、总抗氧化能力试剂盒：南京建成生物工程研究所；黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶（OX）：上海丽臣生物公司；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇以及其他试剂均为AR级：国药集团。
1.2 细胞培养
人肝癌细胞株HepG2（American Type Culture Collection，ATCC）、 SMMC-7721（中国科学院上海细胞库）与人正常肝细胞L02（中国科学院上海细胞库）培养于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM中，在37 °C，5% CO2的培养箱内生长、传代。
1.3 MTT细胞活力实验
参照文献[6]描述，简要步骤如下：取对数生长期HepG2、SMMC-7721和L0-2细胞接种于96孔板中（调节细胞浓度5×104 个/mL，0.2 mL/孔），培养箱内贴壁生长24 h后，弃去培养基，分别加入含有预设浓度待测样品的培养基 2 mL继续培养。培养至预设时间后分别加入5 mg/mL的MTT 100 μL培养4 h，吸弃培养基，每孔加入150 μL DMSO，酶标仪（TECAN，infinite200）内振摇1 min 后462 nm下测定每孔A值。每个对照组设置5个复孔，同时设不加待测样品的实验对照和不加样品和细胞的空白对照。生长抑制率=[1 − (实验组A值 – 空白组A值)/(实验对照组A值− 空白组A值)] × 100%，并采用GraphPad Prism 6.0 Software 计算IC50值。
1.4 细胞形态分析
运用倒置显微镜以及Hoechst 33258荧光染色法进行细胞形态观察。参照以前文献，简要步骤如下：取对数生长期HepG2细胞接种于6孔板中（调节细胞浓度1×105 个/mL，0.2 mL/孔），培养箱内贴壁生长24 h后，弃去培养基，分别加入含有预设浓度待测样品的培养基 0.2 mL继续培养。培养至预设时间后，在明场下快速拍照。随后小心吸弃培养基，每孔加入1 mL细胞固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1），固定细胞15 min后，立即吸出，并用PBS小心洗涤3次，暗室中每孔加1 mL Hoechst 33258荧光染色液，避光染色30 min。染色后在荧光显微镜下观察细胞核形态并拍照。
1.5 流式细胞术（FACS）检测凋亡
参照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（Vazyme Biotech Co.,Ltd）说明书进行操作，简要步骤如下：取对数生长期HepG2细胞接种于6孔板中（调节细胞浓度1×105 个/mL，0.2 mL/孔），培养箱内贴壁生长24 h后，弃去培养基，分别加入含有预设浓度待测样品的培养基 2 mL继续培养。培养至预设时间后用不含EDTA胰酶消化并在4 °C下离心收集细胞。用预冷PBS洗涤2次，加入100 μL 1×binding buffer重悬细胞。加入5 μL Annexin V和PI staining solution，避光，室温染色10 min。染色后加入400 μL 1×binding buffer混匀，上流式细胞仪进行检测。
1.6 蛋白提取与免疫印迹法
细胞培养与给药参照1.4，消化收集细胞后，使用含有蛋白酶抑制剂与磷酸酶抑制剂的裂解液冰上裂解细胞30 min。离心收集富含蛋白的上清液，参照BCA蛋白测定试剂盒说明书，测定样品蛋白含量。免疫印迹参照文献的方法，简要步骤如下：样品加入10× loading buffer后加热变性。含有等量总蛋白的变性样品使用SDS-PAGE胶分离，并转模至PVDF膜。膜使用5%脱脂牛奶封闭2 h，洗膜后4°C孵育相应的一抗与对应的二抗。蛋白检测使用ECL发光，凝胶成像系统（BIO-RAD ChemiDoc XRS）显影及配套软件计算灰度值。
1.7 总抗氧化能力检测
参照总抗氧化能力检测试剂盒（碧云天）说明书进行操作，简要步骤如下：根据说明书配制各类工作液，96孔板内依次加入过氧化物酶工作液、样品或标准品、ABTS工作液。室温孵育6分钟后414 nm下测定A值。根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。本实验以Trolox作为标准品，样品的抗氧化能力采用Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC)表示（mmol/g）。
1.8 超氧阴离子自由基清除检测
参照超氧阴离子自由基测试盒（南京建成生物工程研究所）说明书，简要步骤如下：根据说明书配制试剂，依次加入指示试剂与样品后涡旋混匀，37 °C水浴40 min；加入显色剂孵育10 min后550 nm检测A值。本实验以Vc作为标准品，样品的抗氧化能力表示为每克样品在37 °C反应40 min所抑制的超氧阴离子自由基相当于1 mg Vc所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为一个活力单位（U/g）。
1.9 羟基自由基清除检测
参照羟自由基测试盒（南京建成生物工程研究所）说明书，简要步骤如下：根据说明书配制试剂，依次加入指示试剂后混匀，37 °C水浴准确反应1 min，加入显色剂终止反应后室温静置20 min后550 nm检测A值。本实验样品抑制羟基自由基能力表示为每毫克样品在37 °C反应1 min，使体系H2O2浓度降低1 mmol/L为一个抑制羟基自由基能力单位（U/mg）。
2.0 黄嘌呤氧化酶活力抑制实验
在黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase，XO）的催化下, 底物黄嘌呤被氧化成尿酸，产物尿酸在295 nm处具有特征吸收峰，因此XO活力可由检测尿酸确定。实验参照文献描述[7]的方法, 使用0.2 mol/L（pH=7.58）磷酸盐反应体系缓冲溶液、底物溶液（20 μg/mL）、酶溶液（1.5 mmoL/L）组成的混合液，在室温 25 °C，295 nm下利用紫外分光光度计的时间-动力学软件，每隔5 s检测一次，连续检测 40 次共计 200 s，在任意的一段时间内，吸光度值与时间的呈线性的增加，斜率为该酶促反应的斜率（d A/min）斜率越大说明酶活力越强。
2.1 统计学处理
使用GraphPad Prism 6.0软件进行数据统计分析。所有数据使用Mean ± SD表示。多组比较采用方差分析 LSD 法。P值＜0.05认为具有显著性差异。
2 结果
2.1 紫茎泽兰抗肝癌作用
2.1.1 紫茎泽兰抗肝癌活性部位
运用MTT法测试紫茎泽兰四个部位对HepG2、SMMC-7721肝癌细胞株的细胞毒作用。如图1所示，EAEA给药剂量为200 μg/mL 时对两种细胞株抑制率分别为90.43%、84.07%。结果表明，EAEA对HepG2、SMMC-7721两种肝癌细胞株皆具有最强的抑制作用，EAPE对HepG2具有较好的抑制作用。EANB与EAW抑制作用较为一般。
图1紫茎泽兰抗肝癌活性部位初筛
2.1.2 EAEA对肝癌细胞的抑制作用
EAEA是紫茎泽兰的有效抗肿瘤部位，为进一步探究EAEA抗肿瘤性能与对正常肝细胞毒性影响，本实验运用MTT法，研究了EAEA对肝癌细胞的时、量效关系，并采用正常人源肝细胞L02对EAEA进行毒性评价。结果表明（图2、表1），EAEA对肝癌细胞的细胞毒作用具有时、量效关系；HepG2给药12、24 和 48 h的IC50分别为108.17 ± 3.72、39.72 ± 4.68 和11.25 ± 3.54 μg/mL。SMMC-7721给药12、24和 48 h的IC50分别为142.32 ± 6.76、52.69 ± 2.98 和 34.28 ± 4.01 μg/mL。此外，L02在EAEA各测试浓度给药后生存率皆超过90%。以上结果可见HepG2对EAEA更为敏感，并且EAEA在给药剂量下对正常细胞影响较小。因此，后续实验中选择HepG2细胞继续进行机制研究，并且使用 20、40与60 μg/mL作为浓度梯度进行实验。
图2 EAEA对HepG2与SMMC-7721抑制作用的时、量效关系与对正常肝细胞的毒性影响
表1 EAEA抑制肝癌活性结果（IC50，μg/mL；mean ± SD，n = 5）
给药时间 Cell lines
HepG2 SMMC-7721
12 h 108.17 ± 3.72 142.32 ± 6.76
24 h 39.72 ± 4.68 52.69 ± 2.98
48 h 11.25 ± 3.54 34.28 ± 4.01
2.1.3 EAEA诱导肝癌细胞凋亡
贴壁细胞发生凋亡在细胞形态方面会出现如变圆悬浮、皱缩、变型、细胞间隙增大等形态改变。如图3A所示，可以发现随着EAEA浓度增加，HepG2形态逐渐发生了典型的凋亡特征。进一步地，使用Hoechst 33258进行细胞核染色。与正常组对比，随着EAEA浓度的增加，表现典型凋亡核改变的细胞不断增多，即细胞染色质密集皱缩，并出现高亮的凋亡小体。
为进一步确认EAEA诱导肝癌细胞凋亡的作用，本研究采用了Annexin V-FITC/PI双染法与检测凋亡相关蛋白进行了验证。在FACS双染法中，非凋亡细胞不能被Annexin V与PI标记，出现在双变量散点图的左下象限（Q3）；早期凋亡细胞被Annexin V标记，出现在右下象限（Q4）；凋亡晚期细胞被Annexin V与PI标记，出现在右上象限（Q2）。流式结果如图3B所示，随着EAEA剂量的增加，早、晚期凋亡的细胞不断增加。PARP与caspase-3是执行线粒体凋亡的关键蛋白。如图3C所示，随着EAEA剂量的增加，作为活性形式的cleaved PARP与cleaved caspase-3不断增加。以上结果都表明EAEA能以剂量依赖的方式诱导HepG2细胞调亡。
图3 EAEA诱导肝癌细胞凋亡。A. 荧光显微镜检测HepG2细胞形态学变化B. FACS检测HepG2细胞凋亡C. 凋亡相关蛋白的变化，0 μg/mL组作为空白对照组，与该组比较，“*”表示P ＜ 0. 05，“**”P ＜ 0. 01。
2.2 紫茎泽兰抗氧化作用
当机体内氧化平衡出现紊乱时，产生的羟基自由基、超氧阴离子等活性氧簇（ROS）无法及时清除；过量蓄积ROS会对核酸等生物大分子造成损害，诱发肿瘤。因此本实验通过检测总抗氧化能力、超氧阴离子清除能力与羟基自由基清除能力，评价紫茎泽兰各部位的抗氧化能力。结果如表2所示，EAEA的总抗氧化能力为0.84 ± 0.21 mmol/g、超氧阴离子清除能力为844 ± 38 U/g、羟基自由基清除能力分别为88 ± 6.3 U/mg。可以看出，EAEA具有良好的抗氧化能力，是紫茎泽兰主要的抗氧化部位。
表2 EAEA抗氧化能力结果 （mean ± SD，n = 5）
提取部位 总抗氧化能力
（mmol/g） 超氧阴离子清除能力（U/g） 羟自由基清除能力（U/mg）
EAPE 0.64 ± 0.12 552 ± 13 68 ± 3.3
EAEA 0.84 ± 0.21 844 ± 38 88 ± 6.3
EANB 0.75 ± 0.08 762 ± 26 34 ± 2.3
EAW 0.42 ± 0.18 689 ± 18 12 ± 6.2
2.3 紫茎泽兰对XO的抑制作用
XO是与ROS生成、炎症反应与尿酸代谢相关的一种酶。在紫茎泽兰提取物-XO反应体系中，不同部位对XO的抑制作用如图4所示，随着各部位浓度的增加，抑制率也随之增大，但是增大的速率在不断的降低。经回归计算，EAPE、EAEA、EANB和EAW对黄嘌呤氧化酶的半数抑制浓度IC50分别为6.65 ± 0.78、3.84 ± 0.64、17.82 ± 4.43和26.07 ± 9.09 mg/mL，其中EAEA对XO抑制效果最佳。
图4 紫茎泽兰对XO的抑制作用
表3 EAEA抑制XO活性结果（mg/mL；mean ± SD，n = 5）
EAPE EAEA EANB EAW
IC50 6.65 ± 0.78 3.84 ± 0.64 17.82 ± 4.43 26.07 ± 9.09
3 讨论
紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng.)是菊科泽兰属丛生型半灌木多年生草本植物，俗称“败马草”、“黑茎草”、“臭草”、“霸王草”等。紫茎泽兰具有较强的竞争替代本地植物的能力，在入侵中国后，广泛定植于广西、云南、贵州等地，造成了不可小觑的生态破坏，严重危害了当地的农、林、畜牧业的生产。紫茎泽兰强烈的化感作用在种群竞争扩张中起到了重要的作用。化感作用不仅可通过抑制种子萌发和植株生长来扼杀、排挤本土植物，形成单优群落，还可通过拒食和毒性物质等减少昆虫和大型动物对其取食甚至毒杀，从而实现成功入侵[8]。但目前各类控制紫茎泽兰的方法在野外应用中均不理想，紫茎泽兰的入侵问题亟待解决[9]。综合开发利用紫茎泽兰是解决该问题的一个新的突破口。紫茎泽兰在对植食性害虫的触杀和驱避等方面的应用研究已经取得了一定的进展，但是紫茎泽兰的药理研究仍是较为薄弱。其实在紫茎泽兰较早入侵的地区如云南，已经对紫茎泽兰的药用积累了一定的应用经验，民间主要应用于外伤、消炎、肿块等[10]。并且研究表明，紫茎泽兰的化感物质具有出强烈的生物活性。其抗增殖与抗炎的特性极具有成为抗肿瘤药物的潜力[11]。因此本实验对EAPE、EAEA、EANB和EAW四个提取部位的抗肿瘤、抗炎、抗氧化活性进行了筛选，以期对紫茎泽兰的药理活性进行评价，同时对开发其他外来入侵物种将有着重要的借鉴和示范意义。
肿瘤的发生是基因突变累积导致的生长失控。尽管如此，许多肿瘤仍然保留了启动细胞凋亡的功能[12]。因此，诱导肿瘤细胞凋亡是控制肿瘤的一种重要手段[13]。本研究结果发现，紫茎泽兰乙酸乙酯部位（EAEA）表现良好的抗肿瘤活性，给药24 h后对HepG2与SMMC-7721细胞的IC50分别为39.72±4.68、52.69±2.98 μg/mL，并且在给药剂量下，对正常人源肝细胞L02几乎无影响。进一步地，可以通过显微镜观察到给药后肿瘤细胞的形态出现了如皱缩、核凋亡小体等典型的凋亡特征；并通过双染法，确认了EAEA能诱导HepG2细胞发生凋亡。Caspase-3与PARP是执行线粒体凋亡的关键蛋白，他们经过剪切后形成活性形式。根据免疫印迹结果分析，EAEA给药后能够引起肝癌细胞cleaved caspase-3与cleaved PARP蛋白含量增加，表明EAEA诱导的凋亡与线粒体凋亡通路的激活相关。
目前，人们越来越重视活性氧簇（ROS）与炎症在肿瘤发生与进展过程中的影响[14; 15]。机体内氧化失衡与持续的炎症可形成恶性循环促使正常细胞发生DNA 损伤、原癌基因突变、基因组不稳定，从而诱发肿瘤。因此本实验还对紫茎泽兰的抗氧化与抗炎能力进行了评价。结果表明，石油醚部位与EAEA部位具有较接近的总抗氧化能力。EAEA能有效清除超氧阴离子与羟基自由基，是一种非常有前景的天然抗氧化剂。XO能催化黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化生成尿酸，并产生过氧化物自由基，与体内尿酸代谢、氧化反应和炎症相关。本研究发现EAEA能抑制XO活性，这可能是EAEA抗氧化与抗炎活性的潜在机制。综上，EAEA是紫茎泽兰的有效抗肿瘤活性部位。EAEA能通过激活肝癌细胞线粒体通路诱导细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤的作用。同时，EAEA具有抗氧化和抑制XO活性的能力。EAEA抗肿瘤作用可能与之相关，表明EAEA具有预防肿瘤发生和影响肿瘤进程的潜力。由此可见，EAEA极具开发为肿瘤药物的价值，继续深入研究EAEA是充分利用紫茎泽兰，化害为宝的一大新途径。
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