李余钊1,2，章仁2,4，郝吉2，陈路3，袁经权1,5*，杨新洲2 *
（1. 南宁师范大学化学与材料学院，广西 南宁 530001；2. 中南民族大学药学院，湖北 武汉 430074；3. 广西药用植物园，广西 南宁 530023；4. 武汉科技大学医学院，湖北 武汉 430074；5. 广西中医药大学科学实验中心，广西 南宁 530200）
摘 要 目的：研究紫茎泽兰的化学成分及生物毒活性。方法：运用中压柱色谱和半制备高效液相色谱等方法对紫茎泽兰的化学成分进行分离纯化，利用现代波谱技术对所得化合物进行结构鉴定，并使用MTT法其进行体外细胞毒活性测试。结果：从紫茎泽兰乙醇提取物中分离得到9个化合物，分别鉴定为反式草木樨苷（1）、对羟基苯甲酸（2）、反式邻羟基肉桂酸（3）、万寿菊素（4）、咖啡酸（5）、芥子醛（6）、对羟基苯甲酸乙酯（7）、黑麦草内酯（8）、圣草酚（9）。MTT筛选结果显示所有化合物在100 μg/mL浓度对HepG2的抑制率均小于45%，化合物5、6对胃癌细胞株7901具有一定抑制作用，抑制率分别为72.5%、62.6%，其余化合物的抑制率均小于21%。结论：化合物4为首次从紫茎泽兰中分到，化合物7、8为首次从泽兰属分到，化合物5、6对胃癌细胞株7901有一定抑制作用。
关键词：紫茎泽兰；化学成分；生物活性
中图分类号：R284.1/R285.5 文献标识码：A
紫茎泽兰 (Eupatorium adenophorum Spreng.)是菊科泽兰属植物，为多年生草本或亚灌木植物。原产中美洲，自上世纪三十年代起入侵我国，现于我国西南地区生长分布，并且迅速往我国东部北部蔓延，对当地的生态环境和经济造成了极大的损坏。在2003年国家环保局公布的首批入侵植物名单中，紫茎泽兰位于首位[1]。对紫茎泽兰进行无害化治理及如何变废为宝是目前亟待解决的问题。紫茎泽兰虽是外来入侵植物，但在短短几十年的蔓延中逐渐被我国劳动人民认识和使用，自上世纪七十年代起，就相继有典籍记载应用中医药理论对其进行临床指导和应用，紫茎泽兰于1975收录于《云南药用植物名录》，据其记载：紫茎泽兰全草清热解毒，活血调经。在感冒发热，疟疾，脱肛，月经不调，跌打肿痛方面有疗效，外用可治香港脚，稻田性皮炎，疮疔，无名肿痛，外伤出血[2]。除此，文献报道紫茎泽兰提取液或主要成分有杀虫、昆虫拒食、毒性、抗肿瘤的作用[3-7]。为充分开发紫茎泽兰，笔者在前期研究紫茎泽兰抗肝癌活性基础上[6-7]，进一步对其化学成分进行了研究，经分离和纯化得到9个化合物，分别鉴定为反式草木樨苷（1）、对羟基苯甲酸（2）、反式邻羟基肉桂酸（3）、万寿菊素（4）、咖啡酸（5）、芥子醛（6）、对羟基苯甲酸乙酯（7）、黑麦草内酯（8）、圣草酚（9），其中化合物4为首次从该植物分离得出，化合物7、8首次从泽兰属分离得出。对分离得出的化合物进行了初步体外细胞毒活性测试，结果显示在浓度为100 μg/mL时，所有化合物对肝癌细胞株HepG2抑制率均小于45%，化合物5、6对胃癌细胞株7901有抑制作用，抑制率分别为72.5%、62.6%，其余化合物的抑制率均小于21%。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Finnigan MAT-95型质谱仪，Waters ACQUITY SQD液相质谱仪； Bruker AVANCE III 600 MHz核磁共振仪（以TMS为内标）；中压色谱制备系统（Alga公司）；Waters 2535半制备型高效液相色谱仪（2998二极管阵列检测器，2707自动进样器）；Thermo Betasil C18半制备柱（150 mm × 20 mm，5 µm；150 mm × 10 mm，5 µm）；大孔树酯D101（青岛海洋化工厂）；薄层色谱硅胶H、柱色谱硅胶（300-400目）（烟台江友硅胶开发有限公司）；MCI凝胶（CHP-20P）（日本三菱化学公司）；葡聚糖凝胶LH-20（GE公司）；HPLC级乙腈（Tedia公司）；Olympus B202型活性测试用显微镜；Spectra Max 340PC型酶标仪；肝癌细胞株HepG2、胃癌细胞株7902（American Type Culture Collection，ATCC）人正常肝细胞株L-02（中国科学院上海细胞库）；MTT（Sigma公司）；胎牛血清、DMEM培养基（上海拜力生物科技有限公司）；双抗（上海博耀生物科技有限公司）。
紫茎泽兰药材于2016年7月采集于广西南宁，经广西中医药大学袁经权教授鉴定为菊科植物紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum Spreng.）的全草，药材标本（No. SC0862）存放于中南民族大学药学院标本馆。
1.2 提取与分离
称取19 kg干燥的紫茎泽兰全草，用95%乙醇冷浸提取得到浸膏，浸膏加入蒸馏水震荡分散后依次加入石油醚，乙酸乙酯，正丁醇进行萃取，萃取后减压浓缩得到相应部位。取180 g乙酸乙酯部位经大孔树酯柱层析得A1-A3部分。其中A1部位有结晶析出，纯化后得化合物1（2.1 g）。102 g A1经中压柱色谱层析以二氯甲烷~丙酮梯度洗脱 (100 : 1→2 : 1，80%乙醇洗脱)，TLC板检测，合并洗脱液得18个组分Fr.1~ Fr.18．其中组分Fr.12、Fr.13、Fr.15、Fr.16分别有晶体析出，经甲醇重结晶得到化合物2（19.7 mg）、化合物3（19.1 mg）、化合物4（11.2 mg）、化合物5（21.1 mg）。113 mg的组分Fr.2经半制备高效液相（Thermo Betasil C18，5 µm，10 mm × 250 mm，乙腈 : 水 = 21% : 79%→49% : 51%，20 min，两相都含有0.1%甲酸，流速为4 mL/min）分离得到化合物6（21.5 mg, tR 7.0 min）；413 mg的组分Fr.4经半制备高效液相（Thermo Betasil C18，5 µm，20 mm × 250 mm，乙腈 : 水 = 19% : 81%→47% : 53%，15 min，两相都含有0.1%甲酸，流速为9 mL/min）分离得到组分Fr.4-1~ Fr.4-4。其中76.6 mg的组分Fr.4-4（tR 14.3 min）经制备薄层色谱（石油醚 : 乙酸乙酯 = 3 : 1, 展开3次）分离得到化合物7（10.3 mg）。135 mg的组分Fr.8经半制备高效液相（Thermo Betasil C18，5 µm，10 mm × 250 mm，乙腈 : 水 = 18% : 82%→23% : 77%, 15 min，两相都含有0.1%甲酸，流速为4 mL/min）进行分离得到化合物 8（30.9 mg）。3.10 g的组分Fr.13经半制备高效液相（Thermo Betasil, C18, 5 µm，20 mm × 250 mm, 乙腈 : 水 = 21% : 79%→21% : 79%，35 min，乙腈 : 水 = 21% : 79%→100% : 0%，5min，乙腈 : 水 = 100% : 0%→100% : 0%，10 min，两相都含有0.1%甲酸，流速为9 mL/min）分离得到组分Fr.13-1~ Fr.13-8。其中2.1 g的组分Fr.13-8经LH-20凝胶柱层析分离得到组分Fr.13-8-1~ Fr.13-8-5。其中388 mg的组分Fr.13-8-4有结晶析出，经甲醇重结晶，得到160.2 mg白色针状晶体，经鉴定为化合物5。1.93 g的组分Fr.14经LH-20凝胶柱层析分离得到化合物9（7.0 mg）。
2 结构鉴定
化合物1：白色固体（甲醇）。ESIMS m/z 325 [M-H]-，327 [M+H]+；1H-NMR (DMSO-d6，600 MHz)：δ 7.91 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-7)，7.67 (1H, dd, J = 1.5, 7.8 Hz, H-6)，7.38 (1H, m, H-4)，7.18 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-3)，7.04 (1H, t, J = 7.8 Hz, H-5)，6.53 (1H, d, J = 16.2 Hz, H-8)，5.00 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-1')；13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz)：δ 123.5 (C-1)，155.9 (C-2)，115.4 (C-3)，131.9 (C-4)，122.3 (C-5)，128.4 (C-6)，139.1 (C-7)，119.8 (C-8)，168.3 (C-9)，100.2 (C-1')，73.6 (C-2')，76.9 (C-3')，69.9 (C-4')，77.3 (C-5')，60.9 (C-6')。其波谱数据与文献报道的化合物一致[8]，故鉴定化合物1为反式草木樨苷。
化合物2：白色针状晶体（甲醇）。ESIMS m/z 137 [M-H]-，139 [M+H]+；1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)：δ 7.89 (2H, m, H-3, 5)，6.837 (2H, m, H-4, 6)；13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)：δ122.7 (C-1)，133.0 (C-2, 6)，116.0 (C-3, 5)，163.4 (C-4)，170.1 (-COOH)。其波谱数据与文献报道的化合物一致[9]，故鉴定化合物为对羟基苯甲酸。
化合物3：白色晶体（甲醇）。ESIMS m/z 163 [M-H]-，165 [M+H]+；1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)：δ 7.94 (1H, d, J = 16.1 Hz, H-7)，7.49 (1H, dd, J = 1.6, 8.1 Hz, H-6)，7.22 (1H, m, H-4)，6.85 (2H, m, H-3, 5)，6.65 (1H, d, J = 16.1 Hz, H-8)；13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)：δ 122.6 (C-1)，158.3 (C-2)，116.9 (C-3)，132.6 (C-4)，120.72 (C-5)，130.0 (C-6)，142.5 (C-7)，118.6 (C-8)，171.3 (C-9)。其波谱数据与文献报道的化合物一致[10]，故鉴定化合物为反式邻羟基肉桂酸。
化合物4：黄色粉末（甲醇）。ESIMS m/z 331 [M-H]-，333 [M+H]+；1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)：δ 7.73 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-2')，7.64 (1H, dd, J = 2.1, 8.5 Hz, H-6'), 6.88 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5')，6.49 (1H, s, H-8)，3.88 (3H, s, 6-OCH3)；13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)：δ 148.2 (C-2)，136.9 (C-3)，177.6 (C-4)，153.6 (C-5)，132.1 (C-6)，153.0 (C-7)，94.7 (C-8)，158.5 (C-9)，104.9 (C-10)，124.1 (C-1')，116.2 (C-2')，146.2 (C-3')，148.8 (C-4')，116.0 (C-5')，121.7 (C-6')。其波谱数据与文献报道的化合物一致[11]，故鉴定化合物为万寿菊素。
化合物5：淡黄色针状晶体（甲醇）。ESIMS m/z 179 [M-H]-，181 [M+H]+；1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)：δ 7.54 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7)，7.04 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2)，6.94 (1H, dd, J = 2.0, 8.2 Hz, H-6)，6.78 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5)，6.23 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8)；13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)：δ 127.7 (C-1)，116.5 (C-2)，146.8 (C-3)，149.5 (C-4)，122.9 (C-5)，115.5 (C-6)， 147.0 (C-7)，115.0 (C-8)，171.0 (C-9)。其波谱数据与文献报道的化合物一致[12]，故鉴定化合物为咖啡酸。
化合物6：黄色粉末（甲醇）。ESIMS m/z 207 [M-H]-，209 [M+H]+；1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)：δ 9.59 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-9)，7.59 (1H, d, J = 15.7 Hz, H-7)，6.99 (2H, s, H-2, 6)，6.71 (1H, dd, J = 7.9, 15.7 Hz, H-8)，3.89 (6H, s, 3, 5-OCH3)；13C-NMR(CD3OD, 150 MHz)：δ 125.1 (C-1)，106.1 (C-2, 6)，148.1 (C-3, 5)，139.2 (C-4)，155.1 (C-7)，125.7 (C-8)，194.7 (C-9)，55.4 (3, 5-OCH3)。其波谱数据与文献报道的化合物一致[13]，故鉴定化合物为芥子醛。
化合物7：白色针状晶体（甲醇）。ESIMS m/z 165 [M-H]-，167 [M+H]+；1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)：δ 7.90 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2, 6)，6.83 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3, 5)，4.32 (2H, q, J = 7.1 Hz, H-8)，1.37 (3H, t, J = 7.1 Hz, H-9)；13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)：δ 122.4 (C-1)，132.7 (C-2, 6)，116.1 (C-3, 5)，168.3 (C-4)，163.6 (C-7)，61.7 (C-8)，14.7 (C-9)。其波谱数据与文献报道的化合物一致[14]，故鉴定化合物为对羟基苯甲酸乙酯。
化合物8：淡黄色晶体（甲醇）。ESIMS m/z 195 [M-H]-，197 [M+H]+；1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)：δ 5.75 (1H, s, H-7)，4.22 (1H, m, H-3)，2.44 (1H, dt, J = 2.8, 13.9 Hz, H-4)，2.01 (1H, dt, J = 2.6, 14.4 Hz, H-2)，1.76 (3H, s, H-11)，1.74 (1H, m, H-4)，1.54 (1H, dd, J = 3.6, 14.4 Hz, H-2)，1.47 (3H, s, H3-9)，1.27 (3H, s, H3-10)；13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)：δ 37.2 (C-1)，48.0 (C-2)，67.3 (C-3)，46.4 (C-4)，185.7 (C-5)，89.0 (C-6)，113.3 (C-7)，174.4 (C-8)，26.9 (C-9)，31.0 (C-10)，27.4 (C-11)。其波谱数据与文献报道的化合物一致[15]，故鉴定化合物为黑麦草内酯。
化合物9：黄色固体（甲醇）。ESIMS m/z 287 [M-H]-, 289 [M+H]+；1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)：δ 6.91 (1H, s, H-2')，6.79 (2H, m, H-5',6')，5.89 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8)，5.88 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6)，5.29 (1H, dd, J = 3.0, 12.8 Hz, H-2), 3.09 (1H, dd, J = 12.8, 17.1 Hz, H-3 ax)，2.71 (1H, dd, J = 3.0, 17.1 Hz, H-3 eq)；13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)：δ 80.5 (C-2)，44.1 (C-3)，197.8 (C-4)， 165.5 (C-5)，97.0 (C-6)，168.4 (C-7)，96.1 (C-8)，164.9 (C-9)，103.3 (C-10)，131.7 (C-1')，114.7 (C-2')，146.5 (C-3')，146.9 (C-4')，116.2 (C-5')，119.2 (C-6')。其波谱数据与文献报道的化合物一致[16]，故鉴定化合物为圣草酚。
3 细胞毒活性筛选
使用MTT法[17]在100 μg/mL浓度下对化合物1~9进行细胞毒活性测试，其MTT筛选结果如表1所示。结果显示所有化合物对肝癌细胞株HepG2抑制率均小于45%，而化合物5、6对胃癌细胞株7901有抑制作用，抑制率分别为72.5%，62.6%，其余化合物的抑制率均小于21%，化合物6对正常肝细胞L-02有60.1%的抑制率。综上所述，分离得出的化合物除化合物5、6对胃癌细胞株7901具有一定的抑制作用外，其他化合物对肝癌细胞株HepG2和胃癌细胞株7901抑制效果甚微。
表1化合物1-4对细胞活力的影响(细胞抑制率, n = 5)
a化合物 细胞株
HepG2 7901 L-02
1 -0.9 20.7 0.1
2 14.5 15.1 14.5
3 11.8 11.9 7.7
4 23.7 18.6 8.8
5 0.6 72.5 -19.8
6 43.7 62.6 60.1
7 38.2 2.9 13.7
8 16.6 10.8 8.9
9 21.2 9.4 31.6
a化合物的细胞毒活性筛选浓度设定为100 μg/mL.
参考文献
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