耐缺氧作用检验方法

1 常压耐缺氧实验
1.1 原理
缺氧对机体是一种紧张性刺激，影响机体各种代谢，特别是影响机体的氧化供能，最终会导致机体的心、脑等主要器官缺氧供能不足而死亡。
1.2 材料
250mL磨口瓶、秒表、凡士林、钠石灰（或等量氢氧化钠和碳酸钙）。
1.3 实验动物
成年健康小鼠，单一性别，18-22g，每组10-15只。
1.4 剂量分组及受试样品给予时间
按体重随机分为1个对照组和3个受试样品剂量组（组间差应不大于1g），其中1个剂量应相当于人体每日每公斤体重推荐摄入量的10倍。受试样品给予时间不少于30天，必要时可以延长。
1.5 实验步骤
各剂量组经口连续给予不同浓度受试样品，对照组给予同等容量溶剂，于末次灌胃后1小时，将各组小鼠分别放入盛有5g钠石灰的250mL磨口瓶内（每瓶1只），用凡士林封瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，以呼吸停止为指标，观察小鼠因缺氧而死亡的时间。
1.6 统计方法及结果判定
缺氧时间为计量数据，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥0.05，P≤0.05，用多个实验组和一对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
受试样品组与对照组比较，存活时间延长，并具有统计学意义，则判定该实验结果阳性。
1.7 注意事项：
1.7.1 每个磨口瓶内最好只放1只小鼠，以防互相干扰影响耐缺氧能力的测定。
1.7.2 磨口瓶一定要密闭封严，以防漏气，否则会影响实验结果。
1.7.3 磨口瓶必须等容量（误差±1ml），实验前先用水加以校正。
1.7.4 每批实验动物的体重应尽量保持一致。
2 亚硝酸钠中毒存活实验
2.1 原量
亚硝酸钠使正常二价铁血红蛋白转变为三价铁血红蛋白，破坏血红蛋白携氧能力，造成组织缺氧死亡。
2.2 材料
亚硝酸钠 秒表 1ml注射器
2.3 实验动物
健康成年小鼠，单一性别，18－20g，每组10－15只。
2.4 剂量分组
同1.4
2.5 实验步骤
各剂量组经口连续给予不同浓度受试样品，对照组给予同等溶量溶剂，于末次灌胃后1小时，各组动物按200－240mg/kgBW剂量腹腔注射亚硝酸钠（注射量为0.1ml/10g），立即计时，记录动物存活时间。
2.6 统计方法及结果判定
存活时间为计量数据，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥0.05，P≤0.05，用多个实验组和一对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
受试样品组与对照组比较，存活时间延长，并具有统计学意义，则判定该实验结果阳性。
3 急性脑缺血性缺氧实验
3.1 原理
动物断头后，由于脑供血终止，在短时间内脑中原有的血液和营养物质尚能使脑功能维持短暂时间，显示出有规律地张口喘气，以喘气时间为指标，可观察受试样品对脑缺血性缺氧的保护作用，凡能使脑耗氧降低的受试样品，均能延长动物喘气时间。
3.2 材料
剪刀 秒表
3.3 实验动物
同2.3
3.4 剂量分组
同1.4
3.5 实验步骤
各剂量组经口连续给予不同浓度受试样品，对照组给予同等容量溶剂，于末次灌胃后1小时，各组动物（以乙醚浅麻醉下）自颈部逐只断头，立即按秒表记录小鼠断头后至张口喘气停止时间。
3.6 统计方法及结果判定
喘气停止时间为计量数据，采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥0.05，P≤0.05，用多个实验组和一对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
3.7 结果判定
常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒存活实验、急性脑缺血性缺氧实验三项实验中至少二项实验结果阳性，可判定该受试样品具有耐缺氧作用。
3.8 注意事项
3.8.1 断头用的大剪刀必须锋利，断头时操作要敏捷，捉拿小鼠不宜反复多次或捉拿时间过长。
3.8.2 断头部位在小鼠耳根后部，切勿损伤延脑，否则断头后小鼠不显现喘气活动。

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